Aus manchen Inhibitorstudien kann man darauf schliessen, wie die katalysierte Reaktion im Detail abläuft und weshalb gewisse Inhibitoren das Enzym so gut binden.
Das Enzym Dihydrpteroat-Synthase (DHPS) katalysiert einen wichtigen Schritt in der Herstellung von Folsäure. Folsäure wiederum wird gebraucht, um eine Reihe von Biomolekülen herzustellen, unter anderem DNS. Wird die DHPS von Bakterien also gehemmt, so können diese Bakterien keine DNS mehr herstellen und sich auch nicht mehr vermehren.
Abbildung 5.1 zeigt, wie man sich den Reaktionsmechanismus vorstellt [1].
Abb 5.1. Katalytischer Mechanismus der DHPS: 1) 7,8-Dihydropterin-6-yl)methyl-diphosphat (Dihydropteridin, 2PH) wird in ein instabiles Zwischenprodukt und Diphosphat gespalten. 2) Das instabile Zwischenprodukt reagiert mit 4-Aminobenzoesäure (pABA) zu Dihydropteroat.¶
In einem ersten Schritt wird das erste Substrat mit dem komplizierten Namen (7,8-Dihydropterin-6-yl)methyl-diphosphat (Kurz: Dihydropteridin, Abkürzung: 2PH) gespalten. Dabei entstehen ein instabiles Zwischenprodukt und ein Diphosphat-Ion.
In einem zweiten Schritt reagiert dieses instabile Zwischenprodukt dann mit 4-Aminobenzoat (pABA, von p-Aminobenzoat) zu Dihydropteroat.
Wieso glaubt man aber, dass der Mechanismus so abläuft? Erstens gibt es chemische Gründe. So ist 4-Aminobenzoat kein sehr reaktives Teilchen und es wäre erstaunlich, wenn die Reaktion ohne das reaktive Zwischenprodukt zustande käme.
Zudem aber deuten röntgenkristallographische Untersuchungen auf diesen Mechanismus hin.
Beim Laden dieser Seite erscheint zunächst die Abbildung A mit dem richtigen Substrat p-Aminobenzoesäure (pABA) und einem Inhibitor mit der Abkürzung HH2, der sich nur geringfügig vom vom zweiten Substrat Dihydropteridin (2PH) unterscheidet. Man darf also annehmen, dass das Zentrum des Enzyms praktisch gleich aussieht, wenn es das echte Substrat 2PH bindet.
Betrachten Sie zuerst die Tertiärstruktur des Proteins. Öffnen sie dazu das Menü oberhalb der Darstellung [Tools ein]:
Wählen sie im Menü die angezeigten Aminosäuren ab und wählen Sie Cartoon (rot eingekreiste Buttons).
Aufgabe 1:Welche Sekundärstrukturen sind an der Bindetasche der Substrate beteiligt?
Aufgabe 2:Welches Substrat wird weiter innen, welches weiter aussen gebunden?. Hinweis: Das richtige Substrat Dihydropteridin (2PH) bindet praktisch gleich wie der abgebildete Inhibitor HH2.
Setzen Sie die Abbildung nun wieder zurück, in dem sie die oben grün eingekreisten Buttons anklicken.
Aufgabe 3:welche Teilchen werden wohl vom Enzym besonders stark gebunden: Dihydropteridin, das instabile Zwischenprodukt oder das Endprodukt Dihydropteroat?
Lösung
Das instabile Zwischenprodukt. Würden die Edukte oder das Produkt besonders stark gebunden, so würden sie das Enzym verstopfen, anstatt zu reagieren. Viel mehr werden jeweils die instabilen Übergangszustände oder Zwischenprodukte besonders stark gebunden werden. Dies erleichtert ihre Bildung (senkt ihre freie Bildungsenthalpie). Und: da sie trotzdem instabil bleiben, reagieren sie auf jeden Fall zu Edukten oder Produkten weiter und können so das Enzym nicht blockieren.
Das Schlüssel/Schloss-Prinzip der Enzyme besagt also nicht, dass Substrate (Edukte) oder Produkte besonders gut durch ein Enzym gebunden werden, sondern instabile Übergangszustände und Zwischenprodukte!
Keine der Darstellungen zeigt die DHPS mit ihren beiden Substraten. Denn wenn tatsächlich die beiden Substrate durch das Enzym gebunden würden, so würden sie sofort miteinander reagieren - oder das Enzym wieder verlassen. Wenn schon, gäbe es in der Kristallstruktur ein wildes Gemisch aus Edukten und Produkten.
Trotzdem können wir ziemlich sicher sein, dass diese Kristallstruktur sehr ähnlich ist wie die Situation im Enzym unmittelbar vor der Reaktion. Der Inhibitor HH2 ähnelt nämlich dem zweiten Substrat 2PH sehr stark, und der Inhibititor XHP hat sogar extrem ähnliche Eigenschaften wie das instabile Zwischenprodukt. Dank dieser Änhlichkeit wird XHP besonders stabil gebunden. Weil HH2 aber nicht reagieren kann (wie das Substrat 2PH) und XHP viel stabiler ist als das zum Zwischenprodukt, können sie beide nicht weiterreagieren, bleiben also im Enzym gebunden und blockieren es. (Es handelt sich um die Enzym-Strukturen 3TYZ (zweiter Button, Abbildung B) und 3TZF (dritter Button, Abbildung C [2]. Abbildung A ist ein Verschnitt).
Experimentell zeigte sich, dass die Wechselwirkung zwischen dem Pseudo-Zwischenprodukt XHP und dem Enzym ausserordentlich stark ist. Dies ist ein starker Hinweis darauf, dass XHP dem tatsächlichen Zwischenprodukt sehr ähnlich sieht.
Aufgabe 4:Zeichnen Sie anhand der Röntgenstruktur die Lewisformeln von XHP und HH2.
Aufgabe 5:In welcher Hinsicht unterscheidet sich HH2 vom tatsächlichen Edukt 2PH? Weshalb reagiert nur 2PH im Enzym, nicht aber HH2?
Aufgabe 6:In welcher Hinsicht unterscheidet sich XHP vom instabilen Zwischenprodukt der Reaktion? Weshalb ist XHP ein stabiles Teilchen, das tatsächliche Zwischenprodukt hingegen nicht?
Die Abbildung des dritten Buttons (Abbildung C) zeigt das Protein mit einem Inhibitor Sulfamethoxazol (der anstelle der 4-Aminobenzoesäure bindet) und dem Inhibitor HH2, der dem natürlichen Substrat sehr ähnlich sieht. Genau wie pABA kann auch Sulfamethoxazol mit dem natürlichen Substrat reagieren (vermutlich gibt es daher auch keine Kristallstruktur mit Sulfamethoxazol und dem zweiten Substrat). Dies ist nicht erstaunlich: Der Vergleich von Abbildung A und Abbildung C zeigt, wie ähnlich sich 4-Aminobenzoesäure und Sulfamethoxazol sind.
Aufgabe 7:Zeichnen Sie die Lewis-Formel des Teilchens, das bei der Reaktion zwischen Sulfamethoxazol und Dihydropteridin entsteht.
Diese Reaktion wird als Fehlsynthese bezeichnet.
Aufgabe 8:Beschreiben Sie, warum dieses Fehlprodukt nicht zur Folsäuresynthese weiterverwendet werden kann.
Welches Teilchen bindet eigentlich besser an das Enzym: 4-Aminobenzoesäure oder Sulfamethoxazol?
Aufgabe 9:Mit welchen Aminosäuren und Wassermolekülen bildet das Subtstrat 4-Aminobenzoesäure Wasserstoffbrücken? Wie viele Wasserstoffbrücken geht es insgesamt ein? Damit Sie die Identität einzelner Aminosäuren feststellen können, klicken Sie im Menü auf „Infos einblenden [Position und Kürzel]“ oder fahren Sie mit der Maus über ein Atom - nach einer Weile erscheinen die entsprechenden Infos.
Aufgabe 10:Mit welchen Aminosäuren und Wassermolekülen bildet der Inhibior Sulfamethoxazol Wasserstoffbrücken und wie viele Wasserstoffbrücken geht er insgesamt ein?
Aufgabe 11:Welches dieser Teilchen wird stärker gebunden? Begründen Sie anhand der eingegangenen Wasserstoffbrücken und hydrophoben Wechselwirkungen.
Aufgabe 12:Angenommen, Sulfamethoxazol würde stärker gebunden: würde das für die Wirkung dieses Antibiotikums eine Rolle spielen?
Mögliche Selektoren: Alle sichtbaren Atome: visible, Aminosäuren der Positionen 199 und 200:199, 200, Protein: protein, Sulfanilamid: SAN, Substrat p-Aminobenzoesäure PAB, Substrat (7,8-Dihydropterin-6-yl)methyl-diphosphat HH2, Wasser: water Histidin oder Wasser: his or water, alle Histidin-Seitenketten der Positionen 60 bis 70: his and 60-70, alle ganzen Aminosäuren (und sonstigen Moleküle), die 5 Å an das Sulfanilamid heranragen: within(group,within(5,san)), bereits ausgewählte Atome: visible.
